Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中迅速扩展

从第一次用到人基底内自身免疫球蛋白到用到1型式肝炎临床病症的令人满意率在学童时期就有很好的描述，多个人基底内自身免疫球蛋白无症状的学童当中有70%在血清转换后10年内患上肝炎，而随访15年的学童这一比重缩减到84%。相对之下，占临床1型式肝炎一半以上的型式1型式肝炎的发病前提还无法给与充分的研究课题。

日渐多的人开始用到分期系统来定义1型式肝炎的令人满意：性状在用到多种人基底内自身免疫球蛋白时转回第1下一阶段，用到低血糖持续性时转回第2下一阶段，用到病症时转回第3下一阶段。一些多发人基底内自身免疫球蛋白无症状的性状，在1期和2期，令人满意速度快，并发展为发病的1型式肝炎。我们之后描述了一第一组在首次样品到多种人基底内自身免疫球蛋白采样后仅仅10年无肝炎的极极快令人满意者，这第一组高血压人数少，但基本特征非常指明。随后，我们发现人基底内自身抗原特异性CD8+T细胞膜底物在令人满意加速的高血压当中基本上不存在，但在更进一步发病和长期存在的肝炎高血压当中很容易样品到。这可能表明，与令人满意高血压相对，这些高血压自身免疫底物的抑制提高。

早期研究课题表明，尽管抑制性T细胞膜(Treg)数量正常，但肝炎高血压存在一些基本功能缺陷，其当中除此以外对IL-2的底物能够降低。此外，肝炎高血压当中的震荡CD4+T细胞膜可能对抑制更具抵抗性，表现为震荡T细胞膜的减缓西移动，自然诱发的Treg和基底外诱发的正向Treg，以及抗原经历的CD4+T细胞膜当中IL-2底物西移动。本研究课题的目的是描述了CD4+抑制性T细胞膜(Treg)在这群人极加速令人满意者当中的基本特征，他们的平均年龄为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

分析方法：BOX研究课题是一项以人群为基础的纵向研究课题，在21岁所列出院的高血压亲族当中核查1型式肝炎的危险因素。我们之后描述了长期加速令人满意者的基本特征，他们保有多重人基底内自身免疫球蛋白无症状超过10年，但无法用到肝炎的临床病症，极快性或非顺利完成性自身免疫。随后，10名继续保有无肝炎并愿意缺少大量血液采样的加速令人满意者纳入T和B细胞膜基本功能分析。在目前的研究课题当中，8名极快令人满意者(SP第一组)，当中位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的人基底内自身免疫球蛋白无症状。所有的旁观者都保持稳定1型式肝炎令人满意的1期，尽管一些人随后失去了人基底内自身免疫球蛋白对某些抗原的无症状底物，然而，一名高血压已经保持稳定2期仅仅6年，但无法用到临床病症，一名高血压被验证为肝炎，该受试者72岁，在收集测试采样时，其HbA1c上升时到53 mmol/mol(7%)，在数据分析当中对该供基底顺利完成了单独评估。分离出来外周血单个核细胞膜(PBMCs)，运用于多参数流式细胞膜术和T细胞膜减缓试验评估供基底当中Treg的频带、遗传式和基本功能。用到FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和紧接著)顺利完成无指派聚类分析，评估Treg遗传式。

结果：与肥胖症供基底相对，来自极快令人满意基底的思绪CD4+T细胞膜的指派聚类结果显示，激活的思绪CD4+ Treg频带缩减，与组胺正向的TNFR相关蛋白(GITR)表述缩减有关。一名HbA1c上升时的高血压与令人满意加速者和匹配的对照第一组相对，Treg五音有所相同。基本功能分析表明，与肥胖症供基底相对，来自加速令人满意基底的Treg酪氨酸的CD4+震荡T细胞膜减缓明显毁损。表现为对震荡CD4+T细胞膜CD25和CD134表述的减缓缩减。

示意图1 深入的遗传式分析结果显示，CD4+Treg亚型式在极快令人满意链表当中缩减。由FlowSOM填充的Treg室，聚集在来自所有供基底的活CD4+CD45RA -细胞膜上。根据上面物表述鉴定出10个元簇:思绪T细胞膜_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;思绪T cell_4;CD49b思绪T细胞膜;HLA-DR + GITR +思绪T细胞膜;寄存器Treg_1;寄存器Treg_2;寄存器Treg_3;和寄存器Treg_4。(a)用到9个相同Treg上面填充的10个元簇的MST。每个节点代表一个空降兵(100个空降兵)，更大的元空降兵(10个元空降兵)在节点第一组附近剪裁。每个节点当中的糕示意图指出单个上面的表述级别。(b)每个元聚类的热示意图，以结果显示整基底上面表述。(c, d)为HD第一组(c)和SP第一组(d)填充示意图，以及FlowSOM识别的每个元簇的很薄。(e-l)比较同位素为每个metacluster木箱曲直通示意图(同位素> 0.05%)确定为HD和SP第一组:寄存器Treg_2 (e),寄存器Treg_3 (f),寄存器Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +思绪T细胞膜(h)、思绪T cell_1(i),思绪T cell_2 (j),思绪T cell_3 (k) n d CD49b思绪T细胞膜(l)。蓝色带子代表ACSSP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对大写字母秩验证。此键适用于示意图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

示意图2 用到CITRUS的预测模型式表明，Treg频带的缩减是令人满意加速的标志。分级奈斯(a - f)和柑橘分析(g-k)比较SP旁观者和匹配的HD旁观者在CD4+CD45RA−T细胞膜上的差异。(a)互补CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l族裔的标志性示意图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3氟化物，然后通过HLA-DR和GITR表述顺利完成分离出来，模拟FlowSOM族裔。(b) HD(黑点)和SP(黑斑)第一组以及供基底SP 606(蓝色)当中CD25+ cd127的频带汇总示意图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+奈斯同构的木箱曲直通示意图;(c) HLA-DRloGITR−(寄存器Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(寄存器Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(寄存器Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+寄存器T cell)。(g - i)柑桔簇折叠由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3表述风力着色，箭头突出的簇被识别为SP和HD链表之间的相同。(j)木箱曲直通示意图结果显示了在SP(黑斑)和HD(灰点)第一组当中，CITRUS思绪Treg_3和Treg_4的比较同位素(比重)。(k)直方示意图结果显示每个簇的遗传式(粉红色)和Treg上面比较表述与背景表述(金色);上列，寄存器Treg_3;下面一行，寄存器Treg_4。背景与所有其他簇当中上面的表述有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对大写字母秩验证

示意图3 与肥胖症献血者相对，令人满意加速者思绪treg的GITR缩减。每个思绪CD4+T细胞膜元簇(思绪T细胞膜_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;CD49b +思绪T细胞膜;HLA-DR + GITR +思绪T细胞膜;寄存器Treg_2;寄存器Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)样品每个表述上面的波动。(a,b)来自HD (a)和S (b)链表的表述热示意图(sp606不除此以外在内)。(c,d)思绪Treg_4元簇当中所有HD(灰色)、所有SP(金色)和SP 606(蓝色)的FlowSOM GITR表述串联，结果显示直方示意图(c)和汇总示意图(d)。Wilcoxon配对大写字母秩和验证，p< 0.07(蓝色)所有供基底除此以外，p< 0.05(金色)供基底SP 606和匹配的HD不除此以外在测试当中。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs当中GITR表述，从分级奈斯，从所有HD(灰色)、所有SP(金色)和SP 606(蓝色)串联，结果显示直方示意图(e)和汇总示意图(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对大写字母秩验证

示意图4 来自加速令人满意的CD4+ treg细胞膜压制震荡CD4+T细胞膜的能够降低。SP第一组用金色的直通和带子指出，HD第一组用红色的直通和带子指出，蓝色的直通/带子指出供基底sp606。用到CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜顺利完成分选。CD4+CD25−(应答者)被上面为CFSE, Treg按推论的比重氢氧化钠。用抗CD3 /28微珠活化细胞膜，培养3过后顺利完成流式细胞膜术样品。(a-d)与CD4+应答者比较应的treg培养(暂时性)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD应答者培养。(a,b,f) CFSE增殖(a,e)和CFSE减缓平均值(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的减缓平均值。用到无症状对照(激活的响应细胞膜不含treg)计算减缓平均值。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

示意图5 震荡CD4+T细胞膜对加速令人满意的T细胞膜活化的减缓更引人注意。SP第一组用金色的直通和带子指出，HD第一组用红色的直通和带子指出，蓝色的直通/带子指出供基底sp606。用到CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜顺利完成分选。CD4+CD25−(应答者)被cfsel上面，treg按推论的比重氢氧化钠。用抗CD3 /28微珠活化细胞膜，培养3过后顺利完成流式细胞膜术(CD25反染)和细胞膜因子分析。HD Treg与HD、SP或sp606应答者共同培养。(a,b) CFSE增殖(a)和CFSE减缓前年(b)。(c,d) CD25减缓前年(c)和CD134减缓前年(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培养当中的表述。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

结论：我们得出的结论是，来自加速令人满意子的活化思绪CD4+Treg在GITR表述当中给与了扩展和丰富，强调了进一步研究课题Treg在1型式肝炎风险性状当中的异质性的必要性。

书名出处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28